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生化分析儀常用分析方法
點(diǎn)擊次數(shù):3080 更新時(shí)間:2010-03-09

生化分析儀常用分析方法共有三大類,分別為終點(diǎn)法、固定時(shí)間法和動(dòng)力學(xué)法。

終點(diǎn)法: 指經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的反應(yīng),反應(yīng)達(dá)到平衡,由于反應(yīng)的平衡常數(shù)很大,可認(rèn)為全部底物(被測(cè)物)轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物,反應(yīng)液的吸光度不再變化,只與被測(cè)物的濃度有關(guān)。這類方法通常稱為“終點(diǎn)”法,更確切地說(shuō)應(yīng)稱“平衡”法。

單試劑單波長(zhǎng)終點(diǎn)法:t1時(shí)刻加入試劑(體積為V),t2刻加入樣本

(體積為S),然后攪拌并反應(yīng),之后開(kāi)始測(cè)量反應(yīng)液的吸光度,

在t3時(shí)刻反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn),t3-t2為測(cè)定時(shí)間。

 

    反應(yīng)度R=At3-At2-1×V/(V+S),或R=At3-ARBLK。

 

    其中: Ati為i時(shí)刻的吸光度,ARBLK為試劑空白吸光度。

單試劑雙波長(zhǎng)終點(diǎn)法: 基本上同“單試劑單波長(zhǎng)終點(diǎn)法”,只是對(duì)于每一個(gè)測(cè)定周期,其實(shí)際吸光度等于Aλ1-Aλ2。

雙試劑單波長(zhǎng)終點(diǎn)法:t1時(shí)刻加入*試劑(體積為V1),t2時(shí)刻加入                                      樣本(體積為S)之后立即攪拌,t3時(shí)刻加入第二試劑(體積為V2)                                               并立即攪拌,t4時(shí)刻反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)。t3-t2為孵育時(shí)間,t4-t3為測(cè)定時(shí)間。

 

在項(xiàng)目參數(shù)中,如果反應(yīng)起始時(shí)間設(shè)為0,則反應(yīng)度R=A時(shí)刻吸光度-雙試劑空白吸光度。    如果反應(yīng)起始時(shí)間小于0,則反應(yīng)度R=At4 -雙試劑空白吸光度-t3到t2間設(shè)定點(diǎn)的吸光度×(V1+S)/(V1+S+V2)。

雙試劑雙波長(zhǎng)終點(diǎn)法: 基本上同“雙試劑單波長(zhǎng)終點(diǎn)法”,只是對(duì)于每一個(gè)測(cè)定周期,其實(shí)際吸光度等于Aλ1-Aλ2。

固定時(shí)間法:又稱為一級(jí)動(dòng)力學(xué)法、二點(diǎn)動(dòng)力學(xué)法等,指在一定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi),反應(yīng)速度與底物濃度的一次方成正比,即v=k[S]。由于底物在不斷的消耗,因此整個(gè)反應(yīng)速度在不斷的減小,表現(xiàn)為吸光度的變化越來(lái)越小。這類反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間很長(zhǎng),理論上可以在任意時(shí)間段進(jìn)行監(jiān)測(cè),但由于血清成份復(fù)雜,反應(yīng)剛啟動(dòng)時(shí)反應(yīng)較復(fù)雜,雜反應(yīng)較多,必需經(jīng)過(guò)一段延遲時(shí)間才能進(jìn)入穩(wěn)定反應(yīng)期。

t1時(shí)刻加入試劑(體積為V),之后測(cè)量試劑空白的吸光度,t2時(shí)刻加入樣本(體積為S),t3時(shí)刻反應(yīng)穩(wěn)定,t4時(shí)刻停止對(duì)反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測(cè);t2-t3為延遲時(shí)間,t3-t4為測(cè)定時(shí)間。

單波長(zhǎng)反應(yīng)度(單雙試劑相同):R=At4—At3

雙波長(zhǎng)反應(yīng)度:R=(t4時(shí)刻主波長(zhǎng)吸光度-t4時(shí)刻次波長(zhǎng)吸光度)--(t3時(shí)刻主波長(zhǎng)吸光度-t3時(shí)刻次波長(zhǎng)吸光度)

動(dòng)力學(xué)法:又稱零級(jí)動(dòng)力學(xué)法,指反應(yīng)速度與底物濃度的零次方成正比,也就是與底物濃度無(wú)關(guān)。因此,在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中,反應(yīng)物可以勻速地生成某個(gè)產(chǎn)物,導(dǎo)致被測(cè)定溶液在某一波長(zhǎng)下吸光度均勻地減小或增加,減小或增加的速度(ΔA/min)與被測(cè)物的活性或濃度成正比。動(dòng)力學(xué)法也被稱為連續(xù)監(jiān)測(cè)法;主要用于酶活性的測(cè)定。

    實(shí)際上,由于底物濃度不可能足夠大,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,底物消耗到一定程度后,反應(yīng)速度不再為零級(jí),因此,零級(jí)動(dòng)力學(xué)法是針對(duì)于特定時(shí)間段而言的;同樣,由于血清成份復(fù)雜,反應(yīng)剛啟動(dòng)時(shí)反應(yīng)較復(fù)雜,雜反應(yīng)較多,必需經(jīng)過(guò)一段延遲時(shí)間才能進(jìn)入穩(wěn)定反應(yīng)期,各試劑商對(duì)這兩段時(shí)間有嚴(yán)格規(guī)定。

t1時(shí)刻加入試劑(體積為V),t2時(shí)刻加入樣本(體積為S),t3時(shí)刻反應(yīng)穩(wěn)定,tn時(shí)刻停止對(duì)反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測(cè);t3-t2為延遲時(shí)間,tn-t3為測(cè)定時(shí)間。 單波長(zhǎng)反應(yīng)度(單雙試劑相同)R=(n∑AT-∑A∑T)/[n∑T2-(∑T)2],其中:n=t3到tn間的數(shù)據(jù)個(gè)數(shù) ,T=時(shí)間 , A=某一時(shí)間的吸光度。雙波長(zhǎng)反應(yīng)度基本同單波長(zhǎng),只是某一時(shí)間的吸光度等于主波長(zhǎng)吸光度減去次波長(zhǎng)吸光度。

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